UNIVERSIDAD NACIONAL DE CHIMBORAZO
FACULTAD CIENCIAS DE LA SALUD
LABORATORIO CLÍNICO E HISTOPATOLÓGICO
TÉCNICAS HISTOLÓGICAS
LIC. IVÁN PEÑAFIEL
ERRORES EN MICROTOMIA
MICHELLE
SÁNCHEZ
3°
SEMESTRE
PERIODO ACADÉMICO
OCTUBRE
2015-FEBRERO 2016
RIOBAMBA-ECUADOR
Cuchillas para
realizar cortes en parafina
Una cuchilla de micrótomo bien afilada tiene dos
ángulos: el primero o ángulo de rumbo, y el segundo, o ángulo de corte
establecido como ángulo de paso. El ángulo de cortes es difícil de ver incluso
con un microscopio de disección. El éxito de la microtomía es dependiente de la
calidad de la superficie cortante en la cuchilla del micrótomo. Es de
importancia crítica tener una cuchilla afilada cuando se realicen cortes, por
tanto ir reaflando la cuchilla (o reemplazar cuchillas desechables) cuando la
calidad de los cortes disminuya.
Las cuchillas de acero pueden ser afiladas con un
afilador automático. Una máquina común, relativamente barata es la piedra
amoladora. Este mecanismo consisite en una lámina de vidrio usada para afilar
la superficie y un brazo metálico para establecer el ángulo. Levantando o
bajando la lámina, los dos ángulos del margen de la cuchilla se pueden formar.
En la operación, la lámina de cristal gira y el brazo se mueve adelante y
atrás. A intervalos periódicos el brazo acercará la cuchilla de la superficie y
se alejará para afilar el otro lado. Se usan dos compuestos dos compuestos para
afilar una cuchilla nueva o dañada. Usar compuestos molientes primero para
eliminar imperfecciones y establecer el ángulo primario. Cuando afiles una
cuchilla de acero nueva, te puede costar varios días moler una superifice
primaria impecable. Usar compuestos para afilar más finos y bajar la lámina de
cristal para afilar el ángulo de desplazamiento secundario, o superficie
cortante. Tanto en una cuchilla nueva como dañada esto te puede costar un día o
dos. Afilar una "buena" cuchilla, afilar el segundo ángulo durante
20-30 minutos. Testar el nuevo margen de la cuchilla con un microscopio de
disección usando iluminación reflejada. El margen cortante devería ser
unmiformemente liso y no mostrar marcas de moliente.
Realizando cortes
en parafina
Utilizar un microtomo de rotación para realizar cortes
en parafina con una grosor de 5 m. Como cada corte es cortada del bloque
de parafina, este se adhiere al corte anterior formando una cinta que puede ser
montada directamente sobre portaobjetos. Para mantenerlos a corto plazo, poner
los portaobjetos en cajas de papel. Los mejores resultados se obtienen cuando
los cortes son de 8-12 m de grosor. Almacenar los bloques que deban
cortarse después en hielo.
Debería obtenerse una cinta de parafina recta desde la
cuchilla de parafina. Cualquier desviación puede ser corregida desbastando las
partes superior e inferior del bloque. Esto es, si cualquier lado es más lago
que el otro, la cinta se puede curvar desde el lado largo del bloque.
Los mayores problemas que plantea la obtención de
secciones en el micrótomo de rotación derivan de una inadecuada orientación de
la cuchilla. Por lo general, a un técnico con suficiente experiencia le basta
la simple observación de la superficie del bloque para reorientar la cuchilla
si fuese necesario. Cuando el ángulo de inclinación es mayor de 15º, y por
tanto el ángulo libre es superior a 8º y el de corte a 60º (cuchilla
excesivamente perpendicular al bloque), el filo tiende a introducirse
profundamente en la parafina del bloque, arrancando parte de ella e induciendo
una fuerte vibración de la cuchilla. Todo ello origina pequeñas ondulaciones en
la superficie del bloque y cortes de grosor muy irregular. Cuando el ángulo de
inclinación es menor de 10º, el ángulo libre es negativo y el corte menor de
60º (cuchilla excesivamente paralela al bloque), el filo de la cuchilla no incide
sobre la superficie del bloque, sino que la faceta inferior de corte se desliza
sobre él. De esta forma no es posible obtener una sección hasta que el bloque
ha avanzado lo suficiente como para salvar la faceta de corte de la cuchilla.
Ello se traduce en la obtención de cortes discontinuos de gran espesor.
Dejando a un lado el problema de los cortes que se
curvan, hay muchos problemas a la hora de realizar cortes así como defectos:
1.
Defecto
Cintas
curvadas
Posible causa
1. Los márgenes superior e inferior del bloque no son
paralelos.
2. La cuchilla no está uniformemente afilada,
provocando mayor compresión de uno de los lados del bloque que del otro.
3. Un lado del bloque está más caliente que el otro.
Solución
1. Desbastar el bloque.
2. Intentar utilizar otra porción del borde de la
cuchilla o afilar la cuchilla.
3. Dejar que
el bloque se enfríe. Buscar las posibles causas del calentamiento o
enfriamiento, tales como lámparas o corrientes de aire.
2.
Defecto
Secciones
comprimidas
Posible causa
1. Cuchilla desafilada.
2. Cera demasiado blanda a temperatura ambiente
para la realización de cortes.
3. La cera está más caliente que la temperatura
ambiente.
Solución
1. Utilizar otra porción del margen de la cuchilla o
afilar la cuchilla. La compresión a menudo sucede cuando se ha redondeado la superficie
de corte producido por los sucesivos afilados.
2. Reinfiltrar en cera adecuada o cortar secciones más
finas. Enfriar el bloque raras veces da buen resultado. La cera debe contener
un solvente contaminante debido a una técnica incompleta de microondas.
3. Enfriar
el bloque a temperatura ambiente.
3.
Defecto
Secciones
que alternativamente son finas con compresión o finas
Posible causa
1. El bloque o la cera que sostiene el bloque al
soporte permanece caliente desde el montaje.
2. El bloque o la cera que sostiene el bloque está
agrietado o flojo
3. Cuchilla perdida.
4. Cuchilla agrietada.
5. Micrótomo defectuoso.
Solución
1. Enfriar el bloque y mantener a temperatura
ambiente.
2. Comprobar el tornillo del soporte. Quitar el bloque
y el soporte del micrótomo, derretir la cera del soporte, y asegurarse que el
soporte está seco. Recubrir el soporte y volver a montar el bloque. Engriar a
temperatura ambiente antes de volver a usarlo.
3. Libera todos los tornillos del soporte y comprueba
en busca de suciedad, arena, o cera blanda. Comprueba el soporte de la cuchilla
en busca de mellas por cera en la superficie de soporte.
4. Desechar la cuchilla.
5. Que un
profesional reacondicione el micrótomo.
4.
Defecto
Secciones
que tienen abultamientos en el centro
Posible causa
1. Algunos solventes permanecen en la muestra.
2. Cera fría en el centro, caliente fuera.
3. Sólo la porción afilada de la cuchilla es aquella
que corta el centro del bloque.
4. Objetos
impregnados con cera dura y encastrados en blando.
Solución
1. Re infiltrar la muestra.
2. Dejar que el bloque se enfríe a temperatura
ambiente. Este es un resultado frecuente al no permitir que los bloques se
enfríen de forma equilibrada.
3. Probar a utilizar otra porción del margen de la
cuchilla o volver a afilar la cuchilla.
4.
Re-infiltrar la muestra.
5.
Defecto
Objetos que
se rompen, o que se hacen añicos por la cuchilla
Posible causa
1. Si el objeto aparece con aspecto "de
tiza" y se hace añicos bajo el filo de la cuchilla, no fue completamente
deshidratado y fue infiltrado defectuosamente.
2. Si el objeto se hace añicos bajo la cuchilla pero
no se hace como tiza, es demasiado duro para cortar en parafina
3. Si el objeto empuja desde la cera pero no se
hace añicos, se ha usado un mal solvente infiltrador, o cera.
Solución
1. Si el objeto es irreemplazable, intentar disolver
la cera, deshidratar hasta EtOH al 95%, infiltrar, y reencastrar, por lo demás
desechar el bloque y comenzar con un material nuevo.
2. Aplicar un spray entre cada uno de los cortes con
celoidina o infiltrar completamente en celoidina o en plástico.
3. Volver a
infiltrar en un medio adecuado usando una parafina diferente que funda a mayor
temperatura.
6.
Defecto
Las cintas
se rompen
Posible causa
1. Una muestra en la cuchilla.
2. Arena en la muestra.
Solución
1. Cambiar a otra porción de la cuchilla.
2. Comprobar el margen de corte del bloque. Si la superficie
está surcada hasta arriba, la arena posiblemente se había arrastrado. Probar
otra parición del margen de la cuchilla. Si los surcos permanecen en su lugar,
analiza minuciosamente. Si hay muchos surcos, desecharlo.
Sin embargo puedes mirar la forma de eliminar depósitos de sílice duros.
7.
Defecto
Las cintas
se pegan al bloque de la cara de la cuchilla
Posible causa
1. La cinta está electrificada, se comprueba si la
cinta se une a todo lo demás.
2. Angulo incorrecto de la cuchilla.
3. El margen superior del bloque tiene fragmentos de
cera.
4. El margen
de la cuchilla (tanto la parte frontal como la trasera) tiene fragmentos de
cera sobre ella.
Solución
1. Echar vaho sobre la cuchilla, incrementar la
humedad ambiental, ionizar el aire, incluso con una llama Bunsen a corta
distancia de la cuchilla.
2. Cambiar el ángulo de la cuchilla.
3. Limpiar la superficie superior del bloque.
4. Limpiar
la cuchilla con xileno.
NO SE FORMAN
CINTAS
8.
Defecto
1. Porque la cera se desmigaja.
2. Porque los cortes, pese a ser perfectos, no se
adhieren el uno al otro.
3. Porque los cortes se enrollan en cilindros.
Posible causa
1. Cera contaminada con algún solvente orgánico.
2. Parafina para usada para infiltrar demasiado
dura, pura.
3a. Se necesita cera demasiado dura a
temperatura ambiente para la realización de cortes más finos.
3b. Angulo
de la cuchilla erróneo.
Solución
1. Re-encastrar (Nota: la cera absorbe vapores de
hidrocarburos).
2a. Sumergir los bloques en cera blanda, recortar los
lados antes de cortar.
2b. Calentar el bloque ligeramente con una bombilla
cerca.
3a. Reinfiltrar en cera adecuada. Si el corte se
realiza muy despacio, y el margen del corte se aguanta flácido con un pincel, a
veces se pueden formar tiras.
3b. Ajustar
el ángulo de la cuchilla.
9.
Defecto
Cortes
de diferente grosor
Posible causa
Juego
en las correderas del micrótomo
Soporte
mal fijado
Porta
bloques caliente
Inclinación
incorrecta
Cuchilla muy usada
Solución
Engrasar
correderas
Fijar
bien la cuchilla y el porta bloques
Enfriamiento
del porta bloques y el bloque
Aumentar
la inclinación de la cuchilla aflojando los tornillos
Cambiar la cuchilla
10. Defecto
Cortes
de espesor irregular
Posible causa
Vibraciones
en partes del microtomo
Vibraciones
en la cuchilla
Juego
en las correderas
Solución
Bloquear
los tornillos del portacuchillas
Reglar
o hacer reglar el micrótomo Cambiar la cuchilla por una menos alta o de cabeza
más larga
11. Defecto
Los
cortes están comprimidos
Posible causa
Cuchilla
desafilada
Temperatura ambiente alta
Solución
Probar
otra zona de la cuchilla
Enfriar el bloque
12. Defecto
Cortes
con estrías
Posible causa
Cuchilla
mal pulimentada
Presencia
de polvo sobre el corte
Soluciones
Probar
otra zona de la cuchilla
Entre
tira y tira limpiar el bisel con una gasa empapada en xilol
El
grosor de los cortes que se obtienen con estos tipos de micrótomos oscila entre
10 y 20 micras, lo que se suele considerar como fino, comparándolo con la
magnitud de las células.
Los
cortes se recogen sobre agua a 36-40ºC, en un baño de María, de aquí se
"pescan" sobre los portaobjetos que, previamente se han impregnado
con una ligera capa de albúmina de Mayer, y se llevan a la estufa, durante
media hora a 58ºC. De esta forma se logra el pegado de los cortes sobre el
porta y la mejor manipulación de éstos en los procesos de desparafinación y
tinción.
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