LÍQUIDOS FIJADORES SIMPLES
Dependiendo del mecanismo de actuación sobre los tejidos podemos clasificar
los líquidos fijos simples en 4 apartados:
Fijadores por deshidratación tisular:
Alcohol etílico y acetona. Son sustancias altamente higroscópicas es decir
absorben agua actúan eliminando tanto el agua libre como el agua ligada a las
proteínas de forma que estas últimas precipitan y disminuyen su solubilidad.
Este cambio proteico es conocido con el nombre de desnaturalización y provoca
importantes alteraciones en la organización y estructura celular y tisular, por
tanto estos agentes fijadores inducen grandes cambios en la morfología orgánica
sobre todo si se emplean como agentes fijadores aislados. Alguno de ellos como
por ejemplo la acetona, altera poco la estructura antigénica tisular y ello se
debe a que estos fenomenitos inducidos son reversibles en parte tras la
rehidratación. El fundamento molecular de la acción deshidratante de los
alcoholes y la acetona, está en la competición que establecen con las proteínas
por las moléculas de agua cuando se encuentra en soluciones concentrada, los
principales agentes fijadores por deshidratación son alcoholes metílico y
etílico, acetona y cloroformo.
Los únicos que se utilizan como fijadores simples son el alcohol etílico y
la acetona.
El alcohol metílico se emplea exclusivamente para la fijación de
extensiones hematológicas.
Alcohol etílico: líquido
claro, transparente o incoloro, volátil, inflamable y de olor agradable. En el
comercio se puede encontrar puro en cuyo caso tiene fuertes gravámenes
tributarios para evitar su utilización clandestina para evitar la fabricación
de bebidas alcohólicas, o bien lo tenemos desnaturalizado diluido al 90 o 70 %.
Como fijador único utilizaremos alcohol a unas concentraciones entre el 70 y
90% y se obtiene cogiendo de 70-90 ml de alcohol puro y se lleva hasta 100 con
agua destilada. La fijación mas potente va a corresponder a las soluciones más
concentradas pero a altas concentraciones la capa externa del tejido se
endurece en exceso, lo que impide la penetración del fijador a la parte interna
de la pieza.
Es un fijador que preserva el glucógeno y la actividad de ciertas enzimas
titulares, fija los pigmentos y se emplea en las extensiones citológicas. Como
altera escasamente la estructura antigénica de los tejidos es un buen agente fijador
para inmuno histoquímica.
Entre las
ventajas del alcohol están:
ü
Fijan y deshidratan al mismo tiempo
ü
Posee una gran velocidad de
penetración
ü
Precipita muy rápidamente las
proteínas y el glucógeno lo que unido a la anterior propiedad aporta extraordinariamente
el tiempo de fijación es un notable agente bactericida y por tanto un buen
conservante.
Entre sus
inconvenientes tenemos los siguientes:
ü
Fijan y deshidratan al mismo tiempo:
es incompatible con muchos fijadores: KCr2 o el OsO3 lo que limita su participación
en muchas mezclas fijadoras.
ü
No fija adecuadamente la cromatina
porque disuelve los ácidos nucleídos y además disuelve parcialmente los
lípidos.
ü
Endurece y contrae excesivamente los
tejidos.
ü
A medida que realiza la fijación se
va diluyendo al incorporar el agua que extrae de los tejidos por lo cual pierde
actividad progresivamente
ü
Prepara mas la tinción porque carece
de efecto mordiente
ü
Puede dar origen a fenómenos de
desplazamiento de sustancias.
Acetona: es un líquido transparente,
inflamable, muy volátil y de olor dulzor. Des hidrata rápidamente y
considerable el tejido por lo que es poco utilizable. El tiempo de fijación
nunca excederá de dos horas y en piezas delgadas son recomendables 20 minutos.
Su uso como fijador está prácticamente limitado a los métodos e inmuno histoquímicos porque conserva muy
bien la estructura antigénica y la actividad enzimática, a veces también se
utiliza en microscopia electrónica para la fijación del material que se va a incluir
en resinas acrílicas. Se emplea generalmente sin diluir a 4ºC, entre sus
inconvenientes mas notables provocan una gran contracción tisular y por tanto
grandes artefactos que suelen hacer inútil su empleo en el microscopio óptico
convencional otro de sus inconvenientes es que debido a su rapidez de acción y
a su capacidad de endurecimiento es imprescindible controlar el tiempo de
fijación.
Todos los fijadores de este grupo son de carácter ácido y se emplean
formando parte de mezclas fijadores. Poseen además una gran velocidad d
penetración en los tejidos y algún poder de descalificación.
Ácido tricloroacético: Son
cristales incoloros cáusticos, solubles en agua en solución al 5 % fija los
nervios de 8 a 20 horas. Nunca se lavan el tejido después de usar éste ácido
porque el edema que produce es excesivo y de lugar a muchos artefactos. Al 2.5
% se usa mezclado con otras sustancias.
Ácido sulfosalicílico: Se usa
al 5% es buen fijador porque permite casi todas las coloraciones endurece
óptimamente los tejidos pero no los contrae después hay que lavar el tejido con
agua pero la fijación debe hacerse en la oscuridad de 6 a 24 horas.
Ácido crómico: Se
emplea en disoluciones al 2% formando parte de mezclas fijadoras, se utiliza
bastante en microscopia electrónica.
Entre las ventajas que tiene:
ü
Excelente fijador estructural y
actúa como mordiente en tinciones que emplean colorantes básicos, entre los
colorantes que tiene es que incompatible con fijadores habituales como el
formol y alcohol.
ü
Escasa velocidad de penetración en
trozos pequeños tarde varios días en penetrar en la pieza
ü
Impregna de coloración verdosa los
tejidos por lo que hay que lavarlos abundantemente en agua destilada tras el
uso de ese acido, los tejidos quedan excesivamente blandos.
FIJADORES POR FORMACIÓN DE SALES CON LOS TEJIDOS
En estos casos el fijador es un
catión metálico fundamentalmente cromo o mercurio o un derivado orgánico como
el ácido pícrico que son susceptibles de formar con los tejidos sales
denominados protenatos metálicos o picratos por lo general todos los agentes d
este grupo poseen gran velocidad de penetración y fijación porque la formación
de la sal, se produce instantáneamente.
Cloruro de mercurio o sublimado: es un
polvo cristalino blanco y venenoso y hay que usarlo bajo campana se usa en
soluciones del 5-6%. El efecto fijador se consigue por la combinación de los
iones de Mercurio con los grupos ácidos de las proteínas especialmente con los
de carácter carboxílico, hidroxílico, sulfidrilo y con los residuos fosfóricos
de las nucleoproteínas.
Entre sus
ventajas tenemos:
ü
Es un excelente fijador de los
caracteres morfológicos celulares por lo que es el de elección para patologías
hematopoyéticas y renales, donde el diagnostico se apoya normalmente en la
observación de finos detallesnucleares y citoplasmáticos.
ü
Es un excelente mordiente por lo que
produce intensa y brillante coloración nuclear y citoplasmática.
Inconvenientes:
ü
No es un buen bactericida por lo que
no es un buen líquido conservante tiene escasa capacidad de penetración por lo
que requiere fraccionamiento cuidadoso del tejido.
ü
Si se prolonga demasiado tiempo de
actuación contrae y endurece los tejidos hasta dificultar el corte en el
micrótomo, por eso nunca deben sobrepasarse las 4 horas de fijación. Tras haber
cumplido esta y común paso previo a la inclusión, los tejidos pueden
conservarse indefinidamente en alcohol etílico al 70%.
Dicromato Potásico: es un
polvo amarillento que reacciona con las proteínas para formar cromatos, se
utiliza en disolución acuosa al 1-2%, fija las proteínas por lo que las
mitocondrias quedan perfectamente conversadas y da un aspecto homogéneo al
núcleo después de la fijación del dicromato deben lavarse abundantemente con
agua.
Es que tiene un fuerte efecto mordiente excelente fijador para lapidar
complejos para mielina, mitocondrias y aparato de Golgi que los contienen en
abundancia. Su utilización es indispensable para técnicas de impregnación
argéntica de las células del sistema nervioso central.
Inconvenientes:
ü
El primero de ellos es incompatible
con alcohol y formol, posee baja velocidad de penetración y endurece
escasamente los tejidos lo que puede dificultar el corte en el microtomo.
ü
Los tejidos han de ser lavados
después de fijados en una solución salina o tamponada para evitar el depósito
de pigmento verde que puede producirse en el curso de la inclusión o coloración
posterior.
Ácido Pícrico: En el
comercio se encuentra en forma de agujas cristalizadas de color amarillo muy
tóxicas de carácter explosivo.
Actúa coagulando las proteínas a través de la formación de picratos que las
confieren gran apetencia por colorantes ácidos. Se utiliza en solución saturada
al 2%, es un excelente fijador estructural que conserva adecuadamente la
composición proteica de los tejidos. Controlando adecuadamente el tiempo de
fijación produce una óptima contracción de los tejidos que favorece su
procesamiento histológico.
Posee una leve acción decalcificante por lo cual puede emplearse como
fijador par a las muestras de tejido óseo.
Inconvenientes:
ü
En estado puro el ácido pícrico es
explosivo si se somete a color hay que mantenerlo alejado de fuentes de color.
ü
Deben dejarse evaporar sus
disoluciones para evitar la formación de precipitados. Si se prolonga el efecto
de fijación que es de 4-18 horas dependiendo de tamaño pieza aparecen
inconvenientes por una excesiva retracción tisular. Sobre todo si la pieza ha
sido inadecuadamente lavado en agua y luego deshidratada.
ü
Tiñe los tejidos de color amarillo y
si no se elimina completamente antes de la inclusión en parafina provoca un
continuo deterioro de la estructura tisular que pueda hacer imposible su
estudio histopatológico algunas semanas después del procesamiento.
ü
La eliminación se realiza mediante
lavados sucesivos en alcohol etílico al 70-80% o en una solución saturada de
LiCO4 en alcohol de 70 es incompatible en la inclusión en celoidina.
MEZCLAS FIJADORAS
Glutaraldehido: líquido
oleoso en comercios se encuentra en disolución al 25%. Mecanismo de actuación
es el mismo que el formaldehído y como fijador se emplea en concentraciones
entre el 1 y el 3%.
Ventajas:
Es el primer fijador de elección para microscopía electrónica porque tienen
una excepcional capacidad para preservar la morfología celular.
Se emplea para fijación de animales por perfusión en patología
experimental.
Inconvenientes:
ü
Tiene velocidad de penetración muy
baja por lo que los fragmentos de tejido no pueden tener volumen superior a
unos pocos milímetros cúbicos.
ü
Posee gran capacidad de retracción y
endurecimiento tisular que impide prolongar el tiempo de fijación por encima de
las 3 horas.
ü
Tiene osmolaridad muy baja por lo
que hay que emplearlo disuelta en soluciones amortiguadoras.
Tetraóxido de Osmio: OsO4: En el
comercio se encuentra en forma de cristales amarillentos solubles en agua, muy
volátiles y tóxicas. Actúa igual que el formol y se prepara como agente fijador
al 1% en tampón fosfato.
Ventajas:
Es el mejor fijador estructural conocido, por eso se utiliza en microscopía
electrónica específicamente como 2º fijador.
Inconvenientes
ü
Muy caro y descompone en preseca de
luz por lo que hay que conservarlo en recipientes opacos y oscuridad.
ü
Aunque sea soluble en agua es
difícil preparar disoluciones acuosas con las que se trabaja
ü
Muy tóxico y en estado cristalino
emite vapores que irritan la córnea mucosa respiratoria. Su manipulación es
obligatoria en una campana de extracción de gases para prevenir la aparición de
queratitis.
ü
Posee muy baja capacidad de
penetración tisular por lo que las muestras deben tener muy poco volumen.
ü
Es incompatible con formol y
dificulta la coloración nuclear, esto obliga a lavar abundantemente los tejidos
tras utilizarlo.
La combinación de diversos fijadores simples formando soluciones, complejas
llamadas mezclas fijadoras pretende sumar las ventajas de cada una de ellas
amortiguando sus inconvenientes. Desde un punto de vista general se clasifican
en dos grupos:
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